Руководство по микробиологии виноделия - Распознавание плесневых грибов и дрожжей

РАСПОЗНАВАНИЕ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ

При определении плесеней пользуются следующими признаками:

1. Строение мицелия (одноклеточный или многоклеточный).
2. Бесполое размножение. Плесени могут размножаться эндоспорами, расположенными внутри спорангиев и на спорангиеносцах, или экзоспорами — конидиями, расположенными на особых гифах-конидиеносцах.
3. Строение спорангиев (у мукоровых).
4. Расположение конидий на конидиеносцах.
5. Форма, размеры и окраска конидий и спор (у всех грибов).
6. Расположение стеригм (ответвления конидиеносцев, несущие конидии).

Для определения плесеней готовят культуры на сусло-желатине, сусло-агаре или на хлебе. Затем из полученной культуры приготовляют препарат, захватив кусочек мицелия с органами плодоношения. Препарат готовят в капле спирта, расщепляя на мелкие кусочки. Поскольку спирт быстро высыхает, его затем отсасывают, а под покровное стекло подводят каплю разбавленного глицерина; потом рассматривают под микроскопом. Лучшие результаты могут быть получены в капельных культурах. Для этого в маленькие капельки стерильного сусла, нанесённые на стерильное покровное стекло, вносят стерильной платиновой иглой споры исследуемого гриба. Это покровное стекло помещают над углублением в предметном стекле, обмазав края вазелином. За прорастанием спор и развитием плесени следят под микроскопом.
По найденным признакам определяют род и вид плесени, используя определитель или ключи для определения плесеней.
Для этого используют:

1. Ключ для определения плесневых грибов, наиболее часто развивающихся на чашках (по Я. Я. Никитинскому и Б. С. Алееву).
2. Ключ для определения плесеней по виду колоний на пивном сусле-желатине (по Н. К. Могилянскому).
3. Ключ для определения под микроскопом плесеней ио плодоношению (по Н. К. Могилянскому).
4. Ключ для определения плесеней по форме и окраске конидий н спор (по Н. К. Могилянскому).

РАСПОЗНАВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ

Для распознавания дрожжей важны следующие признаки:
1. Способ вегетативного размножения.

1. Способность к спорообразованию.
2. Форма спор, способ их образования и характер прорастания.
3. Способность дрожжей усваивать безазотистые углеродсодержащие вещества.
4. Форма клеток.
5. Способность образовывать плёнки.
6. Характер гигантских колоний на твёрдых средах.

Определение способа вегетативного размножения важно для установления того, к какому семейству принадлежат дрожжи (см. в 1-й части «классификация дрожжей»). При этом исследуемые дрожжи выращивают на питательной среде, жидкой или твёрдой, состав которой близок к составу той среды, из которой они взяты. Вполне пригодны для выращивания дрожжей плодово-ягодные среды и солодовое сусло.
Культуры микроскопируют в первые дни развития, устанавливая при этом способ вегетативного размножения — почкование, деление или то и другое. В этом же препарате устанавливают форму клеток, а также способность образовывать плёнки на жидкой среде.
Более сложным является выяснение способности дрожжей к спорообразованию. Это объясняется тем, что для получения спор у дрожжей необходимы специальные питательные среды и соответствующая температура, но и при этом не всегда удаётся заставить дрожжи перейти к спорообразованию. Некоторые дрожжи при выращивании в лабораторных условиях теряют способность к спорообразованию — становятся аспорогенными.

Спорообразование дрожжей обычно достигается двумя путями:

1. Посевом дрожжей на среды, на которых спорообразование наступает после активного вегетативного размножения.
2. Посевом дрожжей на среды, на которых из-за отсутствия питательных веществ вегетативное размножение исключается, и дрожжи вынуждены перейти к спорообразованию.

В разное время предлагались различные питательные среды для выявления спорообразования. Первыми были применены среды из кусочков овощей — моркови, картофеля и др. В настоящее время применяют также свёклу, огурцы, турнепс. Кусочки овощей для предохранения от высыхания помещают на вату, смоченную водопроводной водой, и стерилизуют в пробирках. Позднее было предложено применять отвар из смеси свеклы, моркови, огурцов и картофеля с добавлением равного по весу количества воды. Отвар фильтруют через ткань и добавляют 2% агара при pH = 5,7.
Было предложено также применять среды из консервированных плодовых соков, нейтрализованных едким натром до pH = 6,8, с добавлением агара. Лучшие результаты достигаются прибавлением к этой среде пекарских дрожжей. Для выявления способности к спорообразованию у дрожжей с успехом могут применяться также солодовый агар и желатина. Но самой распространённой средой для выявления способности к спорообразованию у дрожжей, получившей мировую известность - среда Городковой.

Если культивирование дрожжей на одной из указанных выше сред даёт отрицательные результаты, то обращаются ко второму приёму — к методу гипсовых блоков. Для их приготовления берут две части прокалённого гипса и одну часть водопроводной воды, перемешивают и из полученного теста формируют блоки высотой 2 см и диаметром 5 см, которые укладывают на стеклянную пластинку и заполняют гипсовым тестом. Когда блоки затвердевают, их поверхность очищают ножом, укладывают блоки в чашки Петри или Коха и заливают водой до половины их высоты. Затем стерилизуют при 120о в течение 30 минут. После этого на ровную поверхность блока наносят каплю густой взвеси молодой (суточной) культуры дрожжей в солодовом сусле и помещают в термостат при 25—30° Через день-два исследуют под микроскопом на присутствие спор. Некоторые авторы рекомендуют вместо гипсовых блоков использовать среду из агара, сваренного на воде.
Некоторые исследователи считают, что для спорообразования играет также роль та среда, на которой дрожжи предварительно развивались. Для таких сред предлагались различные рецепты, например:
Вода дистиллированная 100 мл
Глюкоза - 5 г
КН2РО4 - 0,2 г
СаС12 - 0,05 г
MgSO4 - 0,05 г
FeSO4 - 0,001 г
(NH4)2SO4 - 0,5 г         

Если же использованием всех указанных приёмов не удаётся обнаружить у дрожжей способности к спорообразованию, можно, по предложению В. И. Кудрявцева, отнести их к тем из спорообразующих дрожжей, которые имеют такой же характер углеводного обмена.
Характерными для каждого вида дрожжей являются также форма спор, способ их образования и прорастания. Все эти данные устанавливают путём микроскопирования, причём для этого требуются определённые навыки. При образовании спор следует проследить, предшествовало ли этому процессу слияние (копуляция) клеток.
За процессом прорастания спор лучше всего наблюдать в полноценных питательных средах в висячей капле.
Для установления способности дрожжей, вызывать брожение углеводов используют бродильные сосуды или трубки Дунбара. В качестве питательной среды используют отвар 200 г прессованных дрожжей или 100 г сухих дрожжей на 1 л водопроводной воды с добавлением исследуемого сахара в количестве 1%.
Обычно исследуют способность дрожжей сбраживать следующие углеводы: глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу. Способность сбраживать рафинозу исследуют только в том случае, если дрожжи сбраживают сахарозу.
О способности дрожжей сбраживать те или иные сахара судят по углекислому газу, который накапливается в закрытом колене бродильного сосуда и вытесняет жидкость.
Так же исследуется способность дрожжей использовать другие источники углерода — спирты и органические кислоты. Спирты добавляют из расчёта 1%, а органические кислоты —  0,2%, кроме уксусной, которую добавляют в количестве 0,1%. Этиловый спирт и кислоты вносят в стерильную среду. В качестве среды используют:

К 100 мл этой среды добавляют 3 мл 0,04%-ного щелочного раствора бромфенолового синего в качестве индикатора и 2г агара. Среду разливают в пробирки и стерилизуют. К ещё горячей среде добавляют спирт или кислоты и дают застыть в косом положении. Затем производят посев дрожжей из водной взвеси петлёй одного и того же диаметра по прямой черте сверху вниз.
Об усвояемости того или иного источника углерода судят по увеличению массы дрожжей по сравнению с контролем.
Для диагностики дрожжей могут быть использованы и гигантские колонии их, так как форма этих колоний характерна не только для каждого вида, но и разновидности (штамма). Для выращивания крупных колоний пользуются большим объёмом питательной среды. Выращивание ведут в чашках Петри или в склянках с косой питательной средой. Посев делают крупной каплей на середину среды.