Руководство по микробиологии виноделия - Основные биохимические процессы, вызываемые микроорганизмами

ГЛАВА V
ОСНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ, И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

РОЛЬ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ПРИРОДЕ, ИХ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И ВИДЫ

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов возникают разнообразные биохимические процессы, продукты которых могут оказаться полезными или вредными для производства. К таким процессам относятся, в первую очередь, различные виды брожений — спиртовое (алкогольное), молочнокислое, уксуснокислое и др., а также процессы гниения. Одни из этих процессов являются полезными и лежат в основе различных производств, другие приносят вред народному хозяйству, и с ними приходится вести борьбу. Один и тот же процесс, в зависимости от направления производства, может оказаться полезным или вредным. Так, например, спиртовое брожение, необходимое в винодельческом производстве, будет вредным в производстве безалкогольного виноградного сока.
Все микробиологические процессы в зависимости от субстрата и условий их протекания делятся на несколько групп:

1. Превращения безазотистых органических веществ в анаэробных условиях (процессы брожения).
2. Превращения азотистых веществ: процессы гниения, аммонификации, нитрификации, денитрификации, азотофиксации.
3. Превращения безазотистых органических веществ в аэробных условиях — процессы окисления.
4. Превращения микроорганизмами соединений серы, фосфора, железа, т. е. неорганических веществ.

ПРОЦЕССЫ БРОЖЕНИЯ

Брожением называется разложение безазотистых органических веществ под действием микроорганизмов. Слово «брожение» происходит от внешнего проявления этого процесса, при котором жидкость под действием выделяющихся газов приходит в движение — «бродит». Слово это устаревшее, т. к. теперь известен ряд брожений, при которых не происходит выделение газа.
Наибольшее практическое значение имеют следующие брожения: спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, 
маслянокислое, ацетонобутиловое, ацетоноэтиловое, брожение пектиновых веществ и клетчатки. В процессе любого брожения происходит распад органического вещества на более простые вещества с меньшим размером молекул, в результате чего освобождается энергия, используемая микроорганизмами.

Спиртовое брожение

Спиртовым или алкогольным брожением называется процесс разложения сахара на спирт и углекислый газ под действием микроорганизмов. Спиртовое брожение известно человеку с древнейших времён. Однако причины его оставались неизвестными до начала XVII столетия, когда спиртовое брожение стали отличать от химических изменений. Газ, выделяющийся при брожении сахаристых жидкостей (СО₂), был назван тогда «винным газом» (gas vinorum).
Изобретение простейшего микроскопа голландцем А. Левенгуком позволило ему рассмотреть осадки выбродивших жидкостей, в которых, как сообщал он в 1680 г., наблюдалось скопление круглых и продолговатых телец. Это и было первое знакомство с дрожжами, хотя Левенгук и не предполагал о существовании связи между открытыми им организмами и процессом брожения. Но уже в конце того же XVII столетия такая связь допускалась (Сталь 1697 г.).
В конце XVIII столетия французский академик Лавуазье произвёл первый количественный анализ веществ, участвующих в брожении, и дал первое уравнение этого процесса, сохранившее, в основном, своё значение и по сей день:
С6Н12О5=2 С2Н5ОН + 2 СО₂.
Как было доказано впоследствии, при этом выделяется 27 ккал энергии. В первой половине XIX века учёные были склонны считать спиртовое брожение чисто химическим процессом, сводя роль дрожжей к катализаторам (Берцеллиус. 1838 г.) или считая брожение результатом разложения отмерших дрожжей (Либих, 1839 г.).
Связь между спиртовым брожением и жизнедеятельностью дрожжей была окончательно установлена Л. Пастером. В 1857 г. он доказал специфичность возбудителей различных брожений. Пастер установил, что при спиртовом брожении масса дрожжей увеличивается до 30 раз, а это доказывает участие в нём дрожжей. Им была создана «виталистическая теория брожения», трактовавшая спиртовое брожение как результат жизненного акта дрожжей. Его тезис «нет брожения без жизни» для своего времени был закономерен. Пастер доказал также образование побочных продуктов брожения —  глицерина и янтарной кислоты, установив тот факт, что брожение протекает сложнее, чем по уравнению Лавуазье.
Уже в 1858 г. М. Траубе высказал предположение, что брожение есть ферментативный процесс. Это получило затем своё подтверждение в работе русской исследовательницы М. М. Мапассеиной, которая, извлекая фермент из дрожжей после их растирания, доказала, что «живые дрожжевые клетки не являются необходимыми для спиртового брожения. Более чем вероятно, что специфические ферменты алкогольного брожения образуются в дрожжевых клетках». (Манассеина. «К учению об алкогольном брожении». Медицинские ведомости, № 8, 1871 г.).
Это высказывание получило окончательное подтверждение в работе немецкого учёного Э. Бухнера (1897 г.), который усовершенствовал методы выделения дрожжевого сока путём прессования, причём исключалась возможность попадания неразрушенных клеток. Выделение содержимого дрожжей (дрожжевого сока) было в дальнейшем упрощено русским биохимиком А. Н. Лебедевым, который применял извлечение водой из высушенных дрожжей.
Способность дрожжевого сока вызывать брожение объясняется содержанием в нём фермента, который, по предложению Бухнера, был назван зимазой. Это вещество, стойкое к антисептикам, при нагревании до 50° полностью теряет способность вызывать брожение. Зимаза относится к эндофермептам, т. е. при жизни клетки наружу не выделяется.

Возбудители спиртового брожения

Основными возбудителями спиртового брожения являются рода Saccharomyces, имеющие наибольшее практическое применение. Это Saccharomyces vini, применяемый в виноделии, и Saccharomyces cerevisiae, используемый в пивоварении и других бродильных производствах. Но, кроме дрожжей, способность к спиртовому брожению проявляют и некоторые мукоровые плесени, образующие до 5—6° спирта, например Monilia — до 6° Слабое спиртовое брожение вызывает также Cidium. В анаэробных условиях проявляют способность к спиртовому брожению и некоторые грибы из семейства аспергилловых. Способность к спиртовому брожению проявляют и некоторые бактерии Sarcina verticuli. Многие виды дрожжей De- baryomyces Hansenii (Кудрявцев), Candida отдельные виды Torulopsis, напротив, совсем не способны к спиртовому брожению.

Химизм спиртового брожения

Уравнение спиртового брожения, предложенное Лавуазье, называет только на начальные и конечные продукты брожения. Оно не отражает те сложные химические превращения, которые претерпевает сахар по пути своего перехода к спирту и углекислоте. Оно также не указывает путей образования многочисленных побочных продуктов брожения, как глицерин, органические кислоты, сложные эфиры, альдегиды и т. д.
Поэтому химизм спиртового брожения был в течение последних ста лет предметом изучения многих исследователей. Большую роль здесь сыграли русские учёные — Л. А. Иванов, С. П. Костычев, А. Н. Лебедев и зарубежные — Нейберг, Мейергоф, Гарден, Парнас, Эйдер и др. 

Эта реакция обратима. В дальнейшем фосфодиоксиацетон под влиянием фермента оксоизомеразы переходит в фосфоглицериновый альдегид.

1. Две молекулы фосфоглицеринового альдегида под действием фермента козимазы вступают в окислительно-восстановительную реакцию (типа Канниццаро), причём одна молекула окисляется за счёт кислорода воды до фосфорноглицериновой кислоты, а вторая молекула восстанавливается водородом воды до фосфороглицерина.

Фосфоглицерин дефосфорилируется и переходит в глицерин, который в небольших количествах накапливается в качестве побочного продукта брожения.

Углекислый газ является конечным продуктом брожения и выделяется во внешнюю среду, а уксусный альдегид восстанавливается в этиловый спирт — также конечный продукт брожения. Этим заканчивается индукционный период брожения. Как только накопится некоторое количество уксусного альдегида, окислительно-восстановительная реакция двух молекул фосфоглицеринового альдегида (фаза III) исключается.

VIII. Наступает так называемое стационарное брожение, в ходе которого окислительно-восстановительная реакция идёт между молекулой фосфоглицеринового альдегида и уксусного альдегида.

Этим объясняется тот факт, что глицерин накапливается в небольших количествах и только в начале брожения.

Образование сивушных масел

В качестве побочных продуктов при спиртовом брожении накапливаются и высшие одноатомные спирты — пропиловый, изобутиловый, изоамиловый, — которые носят техническое название сивушных масел. Они образуются в результате расщепления аминокислот, используемых дрожжами для питания, как источник азота. Этот процесс катализируется протеолитическими ферментами, вырабатываемыми дрожжами. Так, из аминокислоты — лейцина образуется амиловый спирт:

Этот процесс расщепления аминокислоты с выделением азота (тотчас расходуемого дрожжами) носит название дезаминирования.

Глицериновая форма спиртового брожения

Открытие промежуточных продуктов спиртового брожения имело не только теоретическое, но и практическое значение, т. к. оно позволило путём некоторого изменения хода брожения получать вместо этилового спирта глицерин. Это может быть достигнуто введением в бродящую жидкость бисульфита натрия, который, взаимодействуя с уксусным альдегидом, связывает его, образуя альдегидсернистую кислоту.

В результате этого уксусный альдегид выключается из реакции и последняя протекает снова между двумя молекулами фосфоглицеринового альдегида. Это приводит к образованию глицерина, а в качестве побочного продукта накапливается уксусный альдегид. Брожение в этом случае идёт по следующему уравнению:

Практически выход составляет около 40% глицерина от количества сброженного сахара. Глицерин можно получать также путём проведения процесса брожения в щелочной среде. Нормально спиртовое брожение протекает в кислой среде. При подщелачивании бродящей жидкости при помощи углекислых или борнокислых солей натрия или калия или углекислым аммонием наряду с этиловым спиртом образуется глицерин и уксусная кислота по уравнению:

Образование одновременно этилового спирта и глицерина объясняется тем, что в щелочной среде протекают обе окислительно-восстановительные реакции между двумя молекулами фосфоглицеринового альдегида и между молекулами уксусного альдегида, с образованием этилового спирта и уксусной кислоты.

Условия спиртового брожения

1. Сахар.

Дрожжи способны сбраживать моносахариды и дисахариды, особенно сахарозу и мальтозу. Способность сбраживать дисахариды объясняется наличием у дрожжей ферментов сахаразы и мальтазы, расщепляющих дисахариды на моносахариды. Сбраживать крахмал дрожжи не способны, так как они не вырабатывают фермента диастаза (амилазы).
В производстве спирта сырьём служит главным образом крахмал, который поэтому требует предварительного осахаривания. Последнее осуществляется с помощью амилазы солода или плесневой амилазы, получаемой из плесневого грибка. Этот способ, применяемый в последнее время, выгодней, чем с помощью солода, так как на проращивание солода расходуется около 16% крахмала; осахаривание получается менее полным, в результате уменьшается и выход спирта.
На некоторых заводах крахмал осахаривают с помощью серной кислоты. Наиболее благоприятная для брожения концентрация сахара в среде составляет 10—15%. При более высоких и более низких концентрациях энергия брожения падает. При концентрации сахара в 30—35% брожение почти совсем приостанавливается. На этом и основано приготовление натурально сладких вин на основе высокосахаристых сусел. Только дрожжи рода Zygosaccharomyces способны вызывать медленное брожение даже при концентрациях сахара 70—80%.

1. Реакция среды.

Нормально брожение идёт в кислой среде при pH 4—4,5. В щелочной среде ход брожения изменяется, что влияет на конечные продукты. В виноделии виноградный сок имеет всегда кислую реакцию (рН = 3—4). В спиртовой же промышленности для подкисления затора (массы, подготовленной для сбраживания) применяют серную или молочную кислоту. Иногда затор заражают молочнокислыми бактериями (Bact. Delbriickii), которые накапливают необходимую молочную кислоту. При достижении требуемой кислотности затор нагревают, чтобы убить бактерии, а после охлаждения вносят в него дрожжи.

1. Температура.

Оптимальная температура для спиртового брожения находится в пределах 20—30°, минимум 6—8°, максимум 35—40° При 50° брожение полностью прекращается. При понижении температуры ниже оптимальной брожение замедляется, но не останавливается даже при температуре ниже нуля. Холодостойкость дрожжей может быть повышена путём селекции, и это используется при подборе рас для шампанского производства.

1. Спирт.

Для большинства микроорганизмов этиловый спирт ядовит. Однако дрожжи приспособились переносить значительные концентрации спирта. Некоторые расы винных дрожжей выдерживают до 16—17° спирта, а приученные к спирту дрожжи — даже до 20° Ядовитое действие спирта несколько сказывается уже при 2—5° При 5—6° дрожжи прекращают размножение, хотя и не прекращают брожения. С повышением температуры ядовитое действие спирта возрастает.

1. Кислород.

Дрожжи как факультативные анаэробы могут существовать как при наличии кислорода воздуха, так и без него. Как правило, спиртовое брожение протекает в анаэробных условиях. Но на скорость размножения дрожжей сильно влияет доступ воздуха (кислорода). Поэтому в производстве прессованных дрожжей, где нужно выращивать большое количество дрожжевой массы, применяется усиленная аэрация бродящего субстрата.

1. Углекислый газ.

Накопление углекислого газа мало сказывается на дрожжах. Однако большие концентрации углекислого газа приостанавливают брожение и оказывают консервирующее действие, что может быть использовано при изготовлении фруктовых соков. А. М. Шумаков на основании поставленных им опытов считал, что консервирующее действие СО₂ объясняется усилением растворения его под давлением, что наряду с другими факторами действует тормозящим на микроорганизмы. А. М. Фролов-Багреев проводил опыты по консервированию виноградного сока насыщением его углекислотой. В пробах с насыщением до 4—5 атмосфер развитие дрожжей было выявлено через 4—5 месяцев. Пробы с насыщением до 6—7 атмосфер сохранялись в течение года. Поскольку высокие давления представляют неудобства при хранении в бутылках, Фролов-Багреев считал достаточным насыщение до 4 атм., при условии предварительной фильтрации через обеспложивающий фильтр.

Типы спиртового брожения

Различают два типа спиртового брожения — верховое и низовое. В соответствии с этим и дрожжи делятся на верховые и низовые. Верховое брожение происходит при температуре 20—28° Оно протекает бурно, с образованием обильной пены и со значительным помутнением бродящей жидкости. После окончания брожения дрожжи оседают рыхлым слоем.
Верховые дрожжи применяются в производстве спирта и прессованных дрожжей. Низовое брожение протекает при низкой температуре, более спокойно, без образования обильной пены. После окончания брожения дрожжи оседают плотным слоем. Низовое брожение применяется в виноделии и пивоварении, где очень важно, чтобы сброженная жидкость осветлялась быстрее.

Промышленное использование спиртового брожения

Техническое применение спиртового брожения очень велико. Именно этот процесс лежит в основе виноделия, пивоварения, хлебопечения и винокурения (спиртового производства). В виноделии сырьем служит виноградное и плодово- ягодное сусло, содержащее сахар. Состав и качество вина в большой степени зависят от хода брожения и применяемых дрожжей.
В пивоварении сырьём является ячмень (превращаемый в солод), а также хмель и вода. Качество пива в большой степени определяется дрожжами. В производстве спирта сырьём служит главным образом крахмал картофеля и хлебных злаков, который предварительно осахаривается. Затор подкисляют, после чего он сбраживается дрожжами.
В хлебопечении применяют прессованные дрожжи. Образующиеся в процессе брожения спирт и углекислый газ играют важную роль в разрыхлении теста и придают хлебу своеобразный вкус и аромат. Для приготовления кислого теста применяют закваски (тесто, оставшееся от предыдущей выпечки), содержащие, кроме дрожжей, ещё и молочнокислые бактерии. Дрожжи разрыхляют тесто, а молочнокислые бактерии создают определённую кислотность. Спиртовое брожение часто сопутствует молочнокислому — при квашении капусты, изготовлении кваса, кумыса, кефира.

Микроорганизмы — вредители спиртового брожения

Вредителями бродильных производств являются различные дрожжи и бактерии. Многие виды диких дрожжей рода Saccharomyces оказываются вредными для производства вина и пива. Особенно опасны здесь плёнчатые дрожжи рода Candida, окисляющие спирт до углекислого газа и воды. Candida опасна также для производства пресованных дрожжей, которое ведётся в аэробных условиях, благоприятных для ее развития. Из бактерий-вредителей особенно опасны уксуснокислые и молочнокислые. Первые окисляют спирт в уксусную кислоту, вторые разлагают сахар до молочной кислоты.