Руководство по микробиологии виноделия - Микробиологический контроль сырья

ГЛАВА II
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СЫРЬЯ, ПОЛУФАБРИКАТОВ И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ

МИКРОКОНТРОЛЬ СЫРЬЯ

К сырью в винодельческой промышленности относят виноград, плоды и ягоды, бекмес, вакуум-сусло, мёд и сахар.
Виноград, плоды и ягоды, поступающие на заводы первичного виноделия, подвергают обязательному микробиологическому контролю с целью определения их микрофлоры. Последняя может быть определена двумя способами: I. Микроскопированием сусла, отжатого из взятой пробы на лабораторном прессе. 2. Микроскопированием смывной воды. Для этого отбирают 50 ягод винограда или 3—10 штук плодов (в зависимости от размеров), помещают в широкогорлую колбу, заливают 100 мл стерильной воды и взбалтывают в течение 5 минут. Смывную воду наливают в центрифужные пробирки, центрифугируют 5—10 минут и осадок микроскопируют
Все эти анализы требуют затраты времени, тогда как виноград необходимо сразу переработать (по инструкции от момента сбора до момента переработки должно пройти не более четырёх часов). Поскольку на поверхности винограда всегда имеется вся характерная для него микрофлора, а больные и повреждённые ягоды можно выявить макроскопическим исследованием, приёмку винограда контролируют по внешним признакам. Осмотром ориентировочно определяют процент недозрелых, повреждённых, загрязнённых и заплесневелых ягод. Результат записывают в журнал по схеме.
Таблица 6

Определение качества винограда, плодов и ягод имеет большое значение, так как от этого зависят дальнейшие приёмы переработки (сортировка, дозы сульфитации и пр.).

Концентраты виноградного сока — бекмес и вакуум-сусло, а также мёд благодаря высокий концентрации сахара устойчивы против микроорганизмов, и только осмофильные дрожжи рода зигосахаромицес могут быть причиной их забраживания и помутнения. Микробиологический контроль проводится для каждой однородной партии при поступлении её на производство, а также по мере надобности при хранении. Цель контроля — предупредить забраживание.
Для анализа отбирают стерильной трубкой образцы из трёх слоёв жидкости. Отобранную пробу центрифугируют в течение 15 минут и осадок микроскопируют. Для определения жизнедеятельности микроорганизмов проводят посев 1 мл концентрата на питательную среду (сусло-агар), подсчитывая затем количество выросших колоний.
Сахар проверяется по внешнему виду на сухость, сыпучесть, запах, а также на содержание микроорганизмов в 1 г. Сахар не должен содержать микроорганизмы, способные развиваться в сусле и вине. Для проверки 1 г сахара растворяют в 5 мл стерильной воды и 1 мл полученного раствора высевают стерильной пипеткой на питательную среду сусло-агар.

МИКРОКОНТРОЛЬ СУСЛА И МЕЗГИ

Сусло и мезга содержат всю микрофлору, которая находилась на поверхности винограда, а также попала с оборудования и ёмкостей, с которыми они соприкасались. Микробиологический контроль сусла проводится до и после отстаивания путём микроскопирования. Пробы отбираются от каждой однородной партии. Целью микроскопирования до отстоя является определение соотношения между культурными и дикими дрожжами, а также выявление наличия бактерий и плесеней. Целью микроконтроля после отстоя является контроль правильности ведения отстоя. Об этом судят по внешним признакам (выделение пузырьков СО₂) и по отсутствию дрожжей в состоянии почкования. Такому же микроконтролю подвергается и мезга красного винограда.
Пробы отбирают при перекачке мезги в бродильный чан от каждой однородной партии и подвергают микроскопированию. Для количественного определения микроорганизмов отбирают в стерильный мерный цилиндр с притёртой пробкой 10 мл мезги и разбавляют её стерильной водой до 100 мл (при необходимости разбавляют больше. А. М. Шумаков рекомендует сразу добавлять больший объём воды). Затем высевают определённый объём жидкости (1 мл) на питательную среду — сусло-агар.

При контроле плодовых соков производят анализ на выявление делящихся дрожжей-кислотопонижателей (Шизосахаромицес ацидодеворакс). Для этого отбирают стерильной пипеткой 0,5 мл отжатого сока в пробирку с 10 мл стерильного яблочного сока, сульфитированного из расчёта 300 мг/л. Пробирку выдерживают 24—48 часов в термостате при температуре 24—26°, после чего жидкость микроскопируют. Наличие дрожжевых клеток цилиндрической формы, размножающихся делением, указывает на присутствие дрожжей-кислотопонижателей, так как другие дрожжи в таких условиях не развиваются.

МИКРОКОНТРОЛЬ ПРОЦЕССА БРОЖЕНИЯ

Объектами микроконтроля при брожении являются: разводка ЧКД на всех стадиях её приготовления, ход процесса брожения и определение времени снятия с дрожжей.

1. Контроль разводки чистых культур дрожжей.

Лаборатория, присылающая чистую культуру дрожжей, гарантирует как чистоту, так и жизнеспособность высылаемой культуры. Однако в лаборатории винзавода присланную культуру необходимо подвергать контролю. Последний начинается с внешнего осмотра. Проверяют цельность посуды, отсутствие загрязнений культуры, что очень хорошо заметно на твёрдой среде. На этикетке обычно указывается дата посева и срок годности чистой культуры. Однако возраст её может быть ориентировочно определён и по внешним признакам. Молодая культура дрожжей имеет вид равномерного налёта. Через 6—10 дней, в зависимости от сухости помещения, по краям колонии появляется белая каёмка. В старых культурах (от одного до трёх месяцев) середина колонии имеет вид толстой серой складчатой массы, а по краям она совершенно белая. Колонии посторонних микроорганизмов на твёрдой среде хорошо обнаруживаются по краям дрожжевой колонии. При этом колонии бактерий мелкие, а колонии плесеней пушистые, с окраской, соответствующей каждому виду плесени.
После внешнего осмотра приступают к микроскопированию. Последнее имеет целью выявить чистоту культуры и физиологическое состояние дрожжей.
Для характеристики физиологического состояния дрожжей определяют общее количество клеток дрожжей в одном мл; количество почкующихся клеток дрожжей; процентное соотношение живых и мертвых клеток; бродильную способность: содержание гликогена.
Подсчёт дрожжей производят при помощи счётной камеры в 1 мл бурно бродящего сусла. Допустимо от 10 до 100 млн. дрожжевых клеток. Количество почкующихся клеток подсчитывают в нескольких полях зрения. 

Соотношения живых и мёртвых клеток определяют прямым подсчётом после окрашивания препарата слабым раствором метиленовой сини (0,01%), от которого мёртвые клетки окрашиваются в синий цвет. Содержание мёртвых клеток допускается в пределах 2,5—5%. Количество упитанных клеток определяют реакцией на гликоген — окрашивание раствором Люголя. Оно должно составить 60—80%. Затем определяют бродильную способность дрожжей, как указано в третьей части.
Микроскопический анализ чистой культуры дрожжей производят на всех стадиях приготовления разводки, начиная от пробирок и кончая бочонком. Микробиологическому контролю подвергается и сусло, предназначенное для приготовления разводки. Контроль сусла осуществляют микроскопированием до и после стерилизации. Целью этого микроконтроля является эффективность стерилизации.
Микроконтролю подвергают также ёмкость (бочонок, баллон), предназначенную для приготовления разводки чистой культуры дрожжей. Контроль осуществляют путём внешнего осмотра, а также исследованием последней смывной воды, которая должна быть прозрачной и бесцветной. Для микроскопического исследования отбирают 10 мл последней смывной воды, центрифугируют и осадок микроскопируют.
Воздух помещения, в котором готовят разводку ЧКД, контролируют один раз в декаду методом Коха.

Микроконтроль бродящего сусла и мезги.

Этот контроль проводится на различных стадиях брожения и ставит своей целью устранение ненормальностей хода спиртового брожения. Даже при нормальном ходе брожения контроль осуществляют для каждой однородной партии при забраживании и в дальнейшем 2—3 раза до снятия с дрожжей.
О ходе брожения судят по следующим признакам: выделению углекислого газа; повышению температуры; уменьшению удельного веса.
Измерение температуры во время брожения производят 2—3 раза в сутки. Одновременно определяют содержание оставшегося сахара (по удельному весу). Полученные данные отмечают на графике, который вычерчивается для каждой партии при брожении в бочках или для каждой отдельной крупной ёмкости. Если произошло замедление хода брожения, то выясняют причины. С этой целью определяют физиологическое состояние дрожжей, наличие в них гликогена, процент мёртвых клеток и засорённость дикими дрожжами и бактериями. Производят также подсчёт дрожжевых клеток в 1 мл бродящего сусла и проверяют бродильную энергию чистой культуры дрожжей.
Причинами замедления или остановки хода брожения могут быть:

1. Отсутствие приёмов отстоя и сульфитации;
2. Низкая или слишком высокая температура брожения;
3. Недостаток для дрожжей питательных веществ, чаще всего азотистых;
4. Высокая доза сульфитации, а также повышенное содержание уксусной кислоты. Последняя может накопиться в медленно забраживающем сусле при высокой температуре;

— Слабость самой культуры дрожжей.
Таким же образом контролируют и бродящую мезгу.
3) Определение времени снятия с дрожжей (микроконтроль молодого вина).
Основной целью микробиологического контроля молодого вина является определение времени снятия его с дрожжей (первой переливки). После окончания брожения дрожжи переходят в осадок, и вино начинает постепенно осветляться. Систематически контролируют степень осветления молодых вин, для чего микроскопируют как осадок, так и вино, определяя микрофлору и физиологическое состояние дрожжевых клеток. Если вино не выбродило полностью, то необходимо создать условия для его дображивания — проветрить путём открытой переливки и повысить температуру помещения. Наличие недоброда точнее всего можно определить химическим анализом на остаточный сахар.
В этот период следует также следить, чтобы дрожжи не перешли в стадию отмирания и автолиза, так как это способствует появлению дрожжевого привкуса и трудно устранимой мути, обязанной продуктам автолиза.
О времени первой переливки судят по следующим признакам:

1. По полноте выбраживания сахара (в сухих винах допускается 1—2 г/л за счёт несбраживающихся сахаров — пентоз)
2. По физиологическому состоянию дрожжей. 75% дрожжевых клеток должны быть лишены гликогена (Вортман). Однако эта проба не отличается достоверностью.

МИКРОКОНТРОЛЬ ЯБЛОЧНО-МОЛОЧНОГО БРОЖЕНИЯ

Яблочно-молочное брожение, или биологическое кислотопонижение, имеет место чаще всего в молодых винах, содержащих яблочную кислоту. Этот процесс, весьма желательный в винах с излишней кислотностью, содержащих большие количества яблочной кислоты, напротив, крайне нежелателен в винах с пониженной кислотностью. Поскольку регулирование этого процесса находится полностью в руках винодела, то очень важным моментом является установление его необходимости и времени окончания.
Вина, подвергающиеся бактериологическому кислотопонижению, микроскопируют не реже одного раза в декаду. При этом определяют количество бактериальных клеток. Пробу для анализа берут из толщи вина. Кроме того, определяют титруемую кислотность и содержание летучих кислот. О начале яблочно-молочного брожения свидетельствует помутнение вина, резкое увеличение количества бактерий и снижение титруемой кислотности на 1—2 г/л. В некоторых винах отчётливо видно выделение углекислого газа. Летучие кислоты прп этом, как правило, остаются без изменения или незначительно возрастают (на 0,2—0,3 г/л).
При контроле необходимо учитывать, что в некоторых высококислотных винах бактерии размножаются чрезвычайно медленно, благодаря чему яблочно-молочное брожение долгое время (месяцами) не проявляется. Но если процесс этого брожения уже начался и вино находится в благоприятных для этого условиях, то независимо от его первоначальной кислотности биологическое кислотопонижение завершится в течение 15—20 суток.
При обнаружении начала кислотного брожения особое внимание уделяют изменению титруемой кислотности, для чего определяют её каждые 4—5 дней. Наиболее ответственная задача контроля — своевременно определить момент завершения яблочно-молочного брожения, т. е. установить, когда бактерии разложили всю яблочную кислоту. Так как содержание яблочной кислоты в винах значительно колеблется (от 0 до 8 г/л), то снижение титруемой кислотности ещё не является достаточно показательным. Необходимо определить ещё и яблочную кислоту. Для этого рекомендуется довольно быстрый и простой хроматографический метод.
Определять яблочную кислоту необходимо лишь в конце биологического кислотопонижения, когда титруемая кислотность вина снизится примерно до 8 г/л. Если яблочная кислота уже не обнаруживается, то необходимо быстро освободить вина от бактерий. Для этого применяют дополнительную сульфитацию из расчёта 100—120 мг/л, оклейку (лучше бентонитом) и последующую фильтрацию. Обработанные таким образом вина будут биологически стабильны и готовы к розливу.