Главные цели автора статьи состояли в том, чтобы продвинуть понимание биологии этой болезни на виноградниках, а также разработать инструменты борьбы этой болезнью. Показаны методы диагностики и процедуры, позволяющие свести к минимуму присутствие возбудителя бактериального рака.
Томас Берр (Thomas Burr) – профессор отдела патологии и микробиологии растений, школа интегративной науки о растениях, Корнельский университет, Нью-Йоркская сельскохозяйственная экспериментальная станция, Женева, Нью-Йорк (School of Integrative Plant Science, Cornell University, New York State Agricultural Experiment Station, Geneva, NY)
Я ценю возможность написать этот обзор, в котором я обобщаю исследовательские успехи, наиболее актуальные для винодельческой промышленности в Нью-Йорке, сделанные членами моей лаборатории по исследованию винограда.
Отправная точка.
Ключевым открытием, сделанным в Венгрии в конце 1960-х годов, было то, что бактерия Agrobacterium vitis (в то время называемая Agrobacterium tumefaciens) системно выживает в виноградной лозе и поэтому находится в находящихся в состоянии покоя черенках (Lehoczky, 1971) (рис. 1). Мне повезло в 1980-х годах встретиться с доктором Янушем Лехоцки (Janus Lehoczky) и сотрудничать на протяжении всей моей карьеры с венгерскими учеными, а также с несколькими другими регионами мира, где есть проблема бактериального рака (Crown Gall). Наши главные цели состояли в том, чтобы продвинуть понимание биологии этой болезни на виноградниках, а также разработать инструменты борьбы этой болезнью.
Рисунок 1. Бактериальный рак на штамбе виноградного куста. Раны, полученные растением в процессе прививки или от повреждений морозами являются основными причинами для начала развития инфекции.
Ранее мы установили, что штаммы A. vitis (как вызывающие, так и не вызывающие бактериальный рак) распространены по всему виноградному растению. Галлообразующие штаммы вызывают рак, а оба типа вызывают некроз (гибель ткани), который наиболее легко наблюдать на корнях винограда. В настоящее время нами изучается значение некроза на ранних стадиях роста и развития прививки винограда.
Генетическое разнообразие.
Совместный исследовательский проект с доктором Леоном Оттен (Dr. Leon Otten) показал, что бактерия A. vitis очень разнообразна генетически (Otten et al., 1990). Мы определили это, исследуя генетическую изменчивость локусов у бактерии, которая вызывает возникновение инфекции бактериального рака. Расширением этого исследования была возможность изучить бактериальный рак и штаммы A. vitis из Турции. Эта работа, выполненная турецким аспирантом, который окончил учебу в Женеве, Нью-Йорк, охарактеризовала штаммы патогена из центральной Турции, которые были выделены из «местных сортов», которые культивируются в регионе в течение многих лет (Argun et al., 2001). Эти результаты важны при рассмотрении развития патогена и мер борьбы с болезнью. Они также проливают свет на то, почему различия могут наблюдаться у разных видов винограда, у сортов, устойчивых к раку, и как происхождение влияет на развитие биологического контроля.
Раны и бактериальный рак.
Хорошо известно, что для инфицирования растения бактериальный раком необходима раневая поверхность. Важность раны заключается не в том, чтобы обеспечить входную точку для патогена, а скорее для стимулирования реакции растения на рану, инициирующей у растений активный рост клеток, восприимчивых к инфекции бактериального рака. Наша лаборатория в ходе опыта продемонстрировала, что приток ауксина, связанный с заживлением раны, к месту раны стимулирует рост клеток, восприимчивых к инфекции (Creasap et al 2005). Мы также продемонстрировали, что A. vitis может сохраняться в почве в остатках отмерших корней винограда (например, после раскорчёвки) в течение многих лет (Burr et al., 1995). Это исследование помогло нам лучше понять, почему именно выбор места и практики ведения культуры винограда, помогающие избежать ранений куста, являются ключевыми факторами для профилактики бактериального рака.
Сведение к минимуму распространения бактериального рака.
Мы изучили процедуры, позволяющие свести к минимуму присутствие возбудителя в материале распространения.
• Горячая вода. Процедура использования погружения в горячую воду для контроля бактерии A. vitis в срезанных одревесневших черенках винограда была разработана нами совместно с коллегами из Корнелла, Австралии, Италии и Венгрии, а также коммерческими партнерами. Мы продемонстрировали, что количество патогена был значительно снижено в обработанном горячей водой черенке, но не было искоренено полностью (Burr et al., 1989).
• Культура тканей in vitro. Другая процедура предполагает производство посадочного материала винограда через распространение культуры тканей in vitro как средство для устранения патогена A. vitis. Эта работа продолжается до сих пор, но уже она показала, что «чистые» растения могут быть получены этим способом, как было определено с использованием нашего наиболее эффективного метода обнаружения, однако работа еще ведется и необходимы дополнительные исследования этого процесса. В частности, необходимо рассмотреть возможную выживаемость очень небольшого количества этого патогена в кончиках побегах и меристем (см. статью Бактериальный рак в вопросах и ответах).
Улучшенные методы диагностического тестирования.
Долгое время исследования по биологии бактерии A. vitis в окружающей среде были ограниченными, потому что у нас не было чувствительного и эффективного метода обнаружения патогена. В 2013 году Камека Джонсон (Kameka Johnson), работающая в моей лаборатории постдоком (прим.* - постдок (postdoc) - временная ставка в зарубежных научно-исследовательских учреждениях, которую занимают молодые учёные со степенью кандидата наук (Philosophy Doctor, Ph.D.)), разработала метод, основанный на технологии магнитных наночастиц под названием Magnetic Capture Hybridization (MCH) (Johnson et al., 2013) (рис. 2). Эта технология используется вместе с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (MCH, RT-PCR (ОТ-ПЦР)) значительно улучшило наше понимание биологии бактерии A. vitis.
Рисунок 2. Шери Рейд (Cherie Reid) (слева) и Камека Джонсон собирают образцы на винограднике для анализа на наличие бактерии A. vitis. Шери является ведущим специалистом по исследованиям бактериального рака в течение более 25 лет, а Камека Джонсон разработала метод анализа MCH, RT-PCR.
Используя этот метод, мы смогли значительно улучшить наши знания по следующим темам:
• Распределение бактерии внутри виноградного растения.
Мы определили, что бактерия A. vitis случайным образом распределяется в узлах и междоузлиях от основания до апикальных концов находящихся в состоянии покоя побегов. Мы также обнаружили, что патоген сохраняется в спящих почках, на зеленых кончиках побегов и на поверхности листьев в течение всего вегетационного периода (Johnson et al., 2016, Orel et al., 2017). Таким образом, A. vitis сохраняется как внутри, так и снаружи виноградного растения и не ограничивается внутренними тканями растения.
• Присутствие патогена у дикорастущих виноградных лоз в Нью-Йорке и Калифорнии.
Мы обнаружили, что патогенные формы A. vitis сохраняются в диких виноградных лозах (V. riparia) в Нью-Йорке, а также в одичавших лозах, собранных в Калифорнии. Эти данные увеличивают вероятность распространения болезни в возделываемых насаждениях винограда и указывают на наличие дополнительных потенциальных источников возбудителя, которые могут инфицировать «чистые» лозы (Orel et al., 2017).
• Скрининг виноградных лоз для посадки виноградных насаждений.
Мы проанализировали образцы материала из виноградных питомников с использованием метода MCH, RT-PCR и обнаружили, что некоторые из них содержат патоген. Это было относительно новое открытие, которое стало возможным благодаря этому чувствительному методу анализа. В нем указывается на необходимость дополнительной оценки методов производства чистых растений, чтобы определить, как их можно наиболее эффективно предотвращать развитие болезни в питомниках и виноградниках. В нем также указывается на необходимость исследования экономических последствий бактериального рака на кустах, которые заражаются в разное время.
• Оценка культуры тканей in vitro для устранения бактериального рака.
Метод MCH, RT-PCR был чрезвычайно ценным для оценки эффективности распространения культуры тканей in vitro для производства свободных от A. vitis растений. Однако, как упоминалось выше, необходимы дополнительные исследования для проверки эффективности культуры тканей и факторов, которые могут привести ко вторичному заражению виноградных лоз в питомниках и виноградниках.
Влияние A. vitis на прививаемые компоненты.
Выяснив, что патоген случайным образом распределяется в черенках в состоянии покоя и что раны необходимы для возникновения инфекции, мы задались вопросом, может ли присутствие возбудителя на в подвое или привое быть вредным для срастания компонентов прививки и роста виноградной лозы. Первые данные о таком исследовании были опубликован Hao et al., 2017, и в данный момент необходимы дальнейшие исследования для определения более долгосрочных последствий от прививки, чьи компоненты заражены A. vitis.
Биологический контроль.
Биологический контроль бактериального рака у многих видов растений был весьма успешным; однако биологический контроль не эффективен против бактерии A. vitis на виноградной лозе. Поскольку нет эффективного химического контроля для бактериального рака винограда, наша лаборатория и другие учрежедния исследовали другие потенциальные (не химические) кандидаты на биологический контроль бактериального рака у винограда. Мы всесторонне исследовали непатогенный штамм A. vitis за его способность ингибировать бактериальный рак на винограде. Непатогенный штамм A. vitis (F2/5) был первоначально выделен из винограда в Южной Африке (Staphorst et al, 1985).
Наши исследования привели к следующим открытиям:
• При применении F2/5 к ранам на виноградном растении до начала заражения патогенными штаммами, F2/5 ингибирует бактериальный рак, вызванный галлообразующими штаммами A. vitis, но не другими видами Agrobacterium (рис. 3).
• Концентрация F2/5 на ране растения винограда ране должна быть равной или большей, чем концентрация возбудителя болезни.
• Производство галлов бактериального рака некоторыми патогенными штаммами ингибируется F2/5 в большей степени, чем другими патогенными штаммами (то есть ингибирующее свойство проявляется для различный патогенов в разной степени)
• Патоген не уничтожается с помощью F2/5, но предотвращается его возможность вызывать бактериальный рак у винограда.
• Торможение развития бактериального рака обусловлено способностью F2/5 ингибировать вирулентность патогена.
Рисунок 3. Штамм F2/5 ингибирует бактериальный рак винограда, вызванный возбудителем A. vitis (CG49), но не другими видами Agrobacterium, которые обычно не заражают виноград (штамм A. tumefaciens, CG1100)
F2/5, как и другие штаммы A. vitis, вызывает некроз ткани виноградной лозы, что может повлиять на срастаемость компонентов прививки и рост растений (рис. 4). По этой причине мы разработали некроз-негативные, ингибирующие галл-положительные штаммы, полученные из F2/5, которые в настоящее время разрабатываются как потенциальный коммерческий продукт для управления бактериальным раком винограда. Производные были сделаны путем разрушения одиночных генов, которые необходимы для некроза (некроз-отрицательный), но не для ингибирования рака. После завершения дополнительных лабораторных исследований и исследований в теплицах будут проведены широкомасштабные исследования в питомниках винограда.
Рисунок 4. Некроз, вызванный штаммом А. vitis F2/5, на корнях винограда. Другие штаммы A. vitis также вызывают аналогичный характерный некроз корней винограда.
Поддержка
Исследования моей лаборатории были возможны благодаря талантливому и целеустремленному техническому персоналу, студентам и докторантам, с которыми я с удовольствием работал на протяжении многих лет. Их сильная заинтересованность и поддержка, а также плодотворная совместная работа с сотрудниками Женевы и Итаки Корнелл (Geneva and Ithaca Cornell) и коллег из Министерства сельского хозяйства США (USDA) дали возможность получить разнообразный опыт и способность внедрять новые технологии, необходимые для успеха исследований и производства. Вместе с сетью международного сотрудничества исследования были невероятно интересными и полезными. Не менее важным был интерес и поддержка, полученные от виноградарской, винодельческой и питомниководческой промышленности штата Нью-Йорк. Производители со всего штата Нью-Йорк всегда были партнерами в нашей работе и предоставляли не только финансирование, но и виноградники и растительные образцы, и были заинтересованы в разработке новых открытий и средств для их реализации на своем производстве.
Литература:
Argun, N., Momol, M. T., Maden, S., Momol, E., Celek, H., and Burr, T. J., 2001. Characterization of Agrobacterium vitis strains that were isolated from the central Anatolia region. Plant Disease 83:102-107.
Burr, T. J., Ophel, K., and Kerr, A. 1989. Effect of hot water treatment on systemic Agrobacterium tumefaciens biovar 3 in dormant grape cuttings. Plant Disease 73:242-245.
Burr, T. J., and Reid, C. L. 1994. Biological Control of Grape Crown Gall with Non-tumorigenic Agrobacterium vitis strain F2/5. American Journal of Enology and Viticulture 45:213-219.
Burr, T. J., Reid, C. L., Yoshimura, M., Momol, E. A., and Bazzi, C. 1995. Survival and tumorigenicity of Agrobacterium vitis in living and decaying grape roots and canes in soil. Plant Dis. 79: 677-682.
Burr, T. J., Reid, C. L., Yoshimura, M., Momol, E. A., and Bazzi, C. 1995. Survival and tumorigenicity of Agrobacterium vitis in living and decaying grape roots and canes in soil. Plant Disease. Plant Dis. 79:677-682.
Creasap, J. E., Reid, C. L., Goffinet, M. C., Aloni, R., Ulrich, C. and Burr, T. J. 2005. Effect of wound position, auxin and Agrobacterium vitis strain F2/5 on wound-healing and crown gall development in woody grapevine tissue. Phytopathology 95:362-367.
Hao, L., Kemmenoe, D. Orel, D. and Burr T. J. 2017. The impacts of tumorigenic and non-tumorigenic Agrobacterium
vitis strains on graft strength and growth of grapevines. Plant Disease Posted online on 3 Oct, 2017, First Look.
Johnson, K. L., Zheng, D., Kaewnum, S., Reid, C. L., and Burr, T. 2013. Development of a magnetic capture hybridization
real-time PCR assay for detection of tumorigenic Agrobacterium vitis in grapevines. Phytopathology 103: 633-640.
Johnson KL, Cronin H, Reid CL and Burr TJ. 2016. Distribution of Agrobacterium vitis in Grapevines and Its Relevance to Pathogen Elimination. Plant Dis 100:791-796.
Kaewnum, S., Zheng, D., Reid, C. L., Johnson, K. L., Gee, J. C. and Burr, T. J. 2012. A host-specific biological control of grape crown gall by Agrobacterium vitis strain F2/5; Its regulation and population dynamics. Phytopathology103:427-435.
Lehoczky, J. 1971. Further evidences concerning the systemic spreading of Agrobacterium tumefaciens in the vascular system of grapevines. Vitis 10: 215-221.
Martinson, T. and T. Burr. 2012. How Close are We to Crown Gall-free Nursery Stock? Research Focus 2012-1. Appellation Cornell, issue 9, March, 2012. Cornell University.
Orel, D. C., Reid C. L, M. Fuchs and Burr, T. J. 2017. Identifying environmental sources of Agrobacterium vitis in vineyards and wild grapevines. Am. J. Enol. Vitic. 68:2
Otten, L, de Ruffray, P., Momol, E. A., Momol, M. T., and Burr, T. J. 1996. Molecular characterization of North American Agrobacterium vitis strains and detection of a new type of Ti plasmid. MPMI 9:782-786.
Staphorst, J. L., van Zyl, F. G. H., Strijdom, B. W., and Groenewold, Z. E. 1985. Agrocin-producing pathogenic and nonpathogenic biotype-3 strains of Agrobacterium tumefaciens active against biotype-3 pathogens. Current Microbiology 12:45-52.
прим.* - примечание переводчика, перевод Красохиной С.И.
